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實時熒光定量pcr儀的計算原理

Real-timePCR是在PCR擴增過程中,通過熒光信號,對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數時期,模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系,所以成為定量的依據。


技術原理:

在PCR反應體系中,將熒光基因加入,利用熒光信號累積對整個PCR進程進行實時監測,最后通過標準曲線定量分析未知模板的方法,被稱為real-time Q-PCR技術。在 real-time 技術的發展過程中,起關鍵作用的是兩個重要的發現:


1.90年代早期,發現了TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性,其能夠將特異性熒光記探針降解,所以,具備了對PCR產物間接的檢可能性。


2.在這之后,在一密閉的反應管中,可以通過對熒光雙標記探針的運用對反應全過程實時地監測。real-time Q-PCR方法由于這兩個發現的結合以及相應的儀器和試劑的商品化發展在在研究工作中得到了廣泛地運用。


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PCR反應過程中,產生的DNA拷貝數是呈指數方式增加的,隨著反應循環數的增加,最終PCR反應進入平臺期,不再以指數方式生成模板。


在傳統的PCR中,PCR反應的最終擴增產物是通過凝膠電泳分離并且通過熒光染色來檢測的。所以對PCR產物定量的終點法存在不可靠之處。

在real-time Q-PCR中,整個PCR反應擴增過程,對擴增的相關的熒光信號進行了實時的監測和連續地分析。隨著反應時間的進行,監測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲 線。在PCR反應早期,不能明顯地區分產生熒光的水平不能與背景,而后熒光的產生進入指數期、線性期和最終的平臺期,PCR產物的量可以在PCR反應處于指數期的某一點上的時候進行檢測并且對模板最初的含量進行推斷。


相關應用:

應用行業

各級各類醫療機構、大學及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫站、食品企業及乳品廠等。

由于qPCR是實時定量檢測致病病原體基因核酸,因此它比化學發光、時間分辨、蛋白芯片等免疫學方法更具獨到優勢。


科學研究

醫學、農牧、生物相關分子生物學定量研究。


食品安全

食源微生物、食品過敏源、轉基因、乳品企業阪崎腸桿菌等檢測。


動物疾病檢測

禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門菌、大腸埃希菌、胸膜肺炎放線桿菌、寄生蟲病等、炭疽芽孢桿菌。


臨床疾病診斷

各型肝炎、艾滋病、禽流感、結核、性病等傳染病診斷和療效評價;地中海貧血、血友病、性別發育異常、智力低下綜合癥、胎兒畸形等優生優育檢測;腫瘤標志物及瘤基因檢測實現腫瘤病診斷;遺傳基因檢測實現遺傳病診斷。


2019-06-14 17:26:26 瀏覽次數:151次

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