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傳統定量PCR方法

定量PCR(即時聚合酶鏈鎖反應,Real-time Polymerase Chain Reaction,簡稱 Real-time PCR、即時PCR),又稱定量即時聚合酶鏈鎖反應(Quantitative real time polymerase chain reaction,簡稱 Q-PCR/qPCR/rt-qPCR、定量即時PCR、即時定量PCR),是一種在DNA擴增反應中,以螢光染劑偵測每次聚合酶鏈鎖反應(PCR)循環后產物總量的方法技術。下面就讓小編為你具體介紹一下吧。


一、傳統定量PCR方法

1)競爭法:

選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中,用同一對引物同時擴增待測樣品與競爭模板。擴增后PCR產物用內切酶消化。酶將競爭性模板的產物分解成兩個片段,而待測模板不被酶切,兩種產物可通過電泳或高效液相分開,對它們的熒光強度分別進行測定,未知模板的起始拷貝數據已知模板推測。


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2)PCR-ELISA法:

利用地 高 辛或生物素等標記引物,擴增產物被固相板上特異的探針所結合,再加入抗地 高 辛或生物素酶標抗體-辣根過氧化物酶結合物,最終酶使底物顯色。常規的PCR-ELISA法只是定性實驗,若加入內標,作出標準曲線,也可實現定量檢測目的。


3)內參照法:

將已定量的內標和引物加入到不同的PCR反應管中,內標用基因工程方法合成。下游引物不標記,上游引物用熒光標記。在模板擴增的同時,內標也被擴增。在PCR產物中,因為靶模板的長度和內標不一樣,電泳或高效液相可以將二者的擴增分離開來,對它們的熒光強度分別測定,待檢測模板的定量是通過對照內標。


二、內標在傳統定量中的作用

因為PCR到達平臺期后進行檢測是傳統定量方法。但是PCR經過對數期擴增到達平臺期時,具有很差的檢測重現性極差,所以起始模板量無法直接從終點產物量推算,將內標加入后,可以使得產物定量所造成的不準確性部分消除。


三、內標對定量PCR的影響

若將已知起始拷貝數的內標加入到待測樣品中,那么PCR反應變為雙重PCR,雙重PCR反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭特別是兩種模板的起始拷貝數有比較大的差距時,會表現出更加明顯的競爭關系。然而因為待測樣品的起始拷貝數是未知的,所以無法加入合適數量的已知模板作為內標


2019-06-14 17:07:00 瀏覽次數:175次

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